实验质料：
DMEM高糖培养基
FBS/NBS
HT选择培养基
CO2细胞培养箱
细胞计数器
单通道移液枪、多通道移液枪
相差显微镜
生物宁静柜
10μL、200μL、1000μL吸头
96/24/6孔细胞培养板
15mL、50mL无菌离心管
100mm细胞培养皿
T75细胞培养瓶
96孔酶标板
实验准备：
阳性比照：
融合前采对应实验的小鼠眼球血 ，37℃安排2h ，然后4℃安排2h ，最后10000rpm离心10min ，取上清 ，-20℃条件下生存。（使用前提前解冻 ，稀释1000倍备用）
阴性比照：
各个阶段培养基留5ml左右 ，作为阴性比照用。
Elisa检测板准备：
将对应抗原用CB以1μg/ml浓度加入96孔酶标板内（100μl/孔） ，4℃留宿静置包被。用1×PBST洗板2遍 ，清洗结束 ，加入关闭液关闭 ，37℃关闭1h ，用1×PBST洗板2遍 ，拍干水分 ，4℃短期生存 ，-20℃恒久生存。
实验流程：
融合检测：
细胞融合换液后 ，等4~7天 ，视察细胞融合状态 ，大部分细胞培养孔内泛起小细胞团 ，即可开始检测。
用排枪取融合培养上清100μL/孔至包被好的Elisa检测板中 ，因为Elisa检测板来源于外部 ，切记从细胞培养板中单次取液 ，不可重复吸取 ，取一次液换一次枪头 ，避免污染细胞培养板内细胞 ，以及交叉污染影响检测结果。（每块板预留一孔阳性比照孔 ，一孔阴性培养基比照孔）
凭据阴性比照和阳性比照的OD值 ，确定阳性孔 ，取阳性比照OD值得一半以上的数值为阳性。
第一次亚克�。�
凭据融合检测的数据 ，挑选阳性孔 ，将阳性孔中的细胞转移至24孔板中培养扩增 ，凭据细胞生长情况2~3天后接纳Elisa要领复检 ，避免假阳性。
挑选24孔板中复检阳性的孔 ，进行细胞复悬 ，使细胞在培养基中疏散均匀。用细胞计数板进行计数 ，计数完成后 ，凭据计数情况比例稀释细胞悬液 ，凭据1个/孔的密度均匀铺于96孔细胞培养板中 ，一个阳性克隆株铺一块细胞培养板板。[一次亚克隆接纳FBS-DMEM(HT),培养基的血清使用浓度略低于融适时的浓度 ，略高于SP2/0通例培养浓度 ，可凭据5% 进行区分]
画克�。�
一次亚克隆后 ，融合细胞在CO2培养箱中培养4~5天后 ，接纳相差显微镜逐孔视察 ，在单孔内有且只有一个正圆形细胞团的孔 ，即为单克隆细胞孔 ，做好标记。若无无单克隆孔 ，则挑选细胞团较少的多克隆细胞孔 ，做好标记。
一次亚克隆检测：
画克隆后 ，继续培养3~5天 ，凭据细胞生长情况 ，接纳Elisa法进行一次亚克隆检测 ，优选挑选阳性单克隆孔 ，若无阳性单克隆孔 ，则挑选克隆数较少的阳性多克隆孔。挑选出来的细胞株转移至24孔扩增培养 ，进行阳性克隆株复筛 ，确保挑选的细胞株非假阳性。
二次亚克�。�
将一次亚克隆挑选出来的细胞株 ，重复一次亚克隆办法。细胞培养基换成FBS-DMEM ，培养基的血清使用浓度调解成SP2/0的通例培养浓度。
画克隆
二次亚克隆后4~5天 ，进行画克隆 ，单克隆孔做好标记。
二次亚克隆检测：
画克隆后 ，继续培养3~5天 ，重复一次亚克隆检测办法 ，挑选阳性单克隆细胞株 ，准备进行扩增培养。
建株：
阳性单克隆细胞株需进行至少2次的亚克隆 ，检测为全阳方可建株！若为了包管稳定性 ，建议进行第三次亚克隆。
挑出两次检测均为单克隆且全为阳性后 ，在24孔板中培养扩增 ，2~3天后用Elisa法进行交叉检测（主要针对带标签的卵白抗原）和稳定性鉴定。
检测及格后挑选一个细胞状态 ，长势较好且阳性OD值较高的细胞株 ，转移至6孔板进行培养扩增 ，2~3天后 ，用亚型检测试剂盒进行抗体亚型鉴定。
完成以上鉴定后 ，将单克隆细胞株转移至100m细胞培养皿或者T75细胞培养瓶中进行大宗扩增。
扩增完成后将单克隆细胞株进行细胞冻存 ，标记好细胞名称、冻存者、冻存日期等信息 ，安排冻存盒中 ，转移到-80℃冰箱 ，一天后转移至液氮罐中贮存。
冻存后一周再苏醒检测 ，避免细胞株泛起产抗不稳定现象 ，若检测没有问题 ，则将细胞株录入细胞库中 ，并撰写实验报告。（细胞冻存3支/株 ，且3支确保有2个及以上冻存批次 ，制止泛起冻存失误 ，细胞株丧失）
使用到的NEST产品：
10μL、200μL、1000μL吸头
96/24/6孔细胞培养板
15mL、50mL无菌离心管
100mm细胞培养皿
T75细胞培养瓶
96孔酶标板
