界说：
酶联免疫吸附测定（简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上 ，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测要领 。
常用的ELISA可以分为五大类：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、竞争抑制ELISA 。其他的ELISA都由这五类组合衍生 。
所有的ELISA基本由基础的几个办法组合而成：将抗原或抗体吸附到固相载体上；加入待检样品以及后续试剂；温育；洗涤去掉游离未结合的反应物；加入酶检测底物；结果的判读
分类：
1.直接ELISA
将抗原按一定的比例稀释 ，包被到固相载体上 ，加入稀释好的特异性的酶标抗体 ，孵育后加入底物显色并判读结果 。直接ELISA中只经过了一步信号放大 ，所以其灵敏度不是很高
2.间接ELISA
间接ELISA与直接ELISA差别的是 ，与包被好的抗原结合的是非酶标抗体 ，另外再引入第二种抗体（即二抗） 。二抗是经过酶标的 ，它可以与第一种抗体特异性结合 ，最后加入底物显色并判读结果 。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选历程中 ，间接ELISA都是很是重要的实验历程 。
3.夹心ELISA
3.1直接夹心ELISA
3.1.1双抗体夹心ELISA
将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上 ，关闭后加入待检抗原 ，温育后加入第二种抗体（检测抗体） ，捕获抗体和检测抗体可以是针对差别表位的两种单抗 ，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗 ，可是检测抗体需要经过酶标 。
3.1.2双抗原夹心ELISA
原理和操作与双抗体夹心ELISA基内幕同 ，差别的是包被的是抗原 ，待检工具是抗体 ，然后加入酶标抗原 ，再加底物显色 。双抗原夹心ELISA利用特异性的抗原取代酶标二抗 ，所以特异性比间接法更好 。另外 ，由于间接ELISA中使用的二抗一般只能识别IgG ，而双抗原夹心ELISA中任何类似的免疫球卵白都可以被检测出 ，因此 ，双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏 。
3.2间接夹心ELISA
间接夹心ELISA是基于两种差别种属来源的抗体的夹心ELISA ，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体） ，关闭 ，加入待检抗原 ，温育 ，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标 ，作为检测抗体） ，最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体） ，再加底物显色 。与直接双抗夹心ELISA相比 ，其中引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗 ，相当于整个体系的信号增加了一步放大系统 ，最终的结果比直接双抗夹心ELISA更灵敏 。
4.竞争ELISA
将特异性抗体吸附于固相载体外貌 ，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混淆液；而另一组只加酶标记抗原 ，再经孵育洗涤后加底物显色 ，这两组底物降解量之差 ，即为所要测定的未知抗原的量 。这种要领所测定的抗原只要有一个结合部位即可 ，因此 ，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法 。
5.竞争抑制ELISA
预先将抗原包被在固相载体上 ，实验时加入稀释好的待检抗原（或抗体） ，然后依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗 。待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原） 。洗掉被竞争的特异性抗体 ，最后加底物显色 。最终显色的结果与待检抗原（或抗体）量呈反比 。
实验质料：
96孔高吸附酶标板[NEST]
10μL/200μL/1000μL吸头[NEST]
单通道移液枪、多通道移液枪
微量离心管[NEST]
显色液（A/B液）
15/50ml离心管[NEST]
洗液（PBST）
终止液（H2SO4）
BSA卵白
稀释液（PBS）
包被液（CB）
全波段酶标仪
恒温箱
实验流程：
以使用比较广泛的间接ELISA为例 ，简述实验历程
1.抗原包被：
将对应抗原用CB稀释至1ug/ml ，加入96孔酶标板孔中 ，每孔100ul ，4℃包被留宿 ，之后进行下一办法 。若实验时间比较紧张 ，包被后可安排恒温箱内 ，37℃包被3h后即可进行下一步操作 。
2.洗板：
将酶标板内的包被液甩干 ，用洗液（PBST——0.2%的吐温20 PBS）清洗酶标板2次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留 。
3.关闭：
用PBS充分溶解BSA卵白制备成关闭液（体积比为5~10%） ，将关闭液加入酶标板孔中 ，每孔150ul ，恒温箱37℃关闭1h 。若实验时间安排充裕 ，可在4℃条件下关闭留宿 。
【若抗原内含有偶联BSA分子 ，则更换关闭身分 ，可用羊血清取代】
4.洗板：
将酶标板内的关闭液液甩干 ，用洗液（PBST）清洗酶标板2次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留 。
【若暂无使用需求 ，可将包被后的酶标板安排-20℃条件下贮存 ，需要时解冻使用即可 。】
5.一抗：
用PBS稀释液将待检样品（含有对应抗原的抗体）按需求稀释 ，再将稀释后样本加入包被好的酶标板中 ，每孔100ul ，阴性比照孔加入100ulPBS稀释液 ，在恒温箱中37℃孵育1h 。
6.洗板：
将酶标板内的一抗甩干 ，用洗液（PBST）清洗酶标板3次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留 。
7.二抗：
用PBS稀释液凭据说明 ，稀释对应的酶标二抗 ，将稀释完成的二抗加入一抗孵育完成的酶标板中 ，每孔100ul ，恒温箱37℃孵育30min 。
8.洗板：
将酶标板内的二抗甩干 ，用洗液（PBST）清洗酶标板4次 ，并拍干板内液体 ，使之无余液残留 。
9.显色：
将显色液A/B液等体积混淆 ，配置成显色液 ，加入二抗孵育完成的酶标板中 ，每孔100ul ，恒温箱避光37℃反应5~10min 。
【显色液现配现用 ，不可提前配置】
10.终止与读数：
显色完成后 ，无须抛弃显色液 ，直接加入终止液（H2SO4）终止反应 ，每孔50ul ，随即转移至全波段酶标仪450nm单波长度数 ，或450nm/620nm双波长读数 ，念书完成后处理数据 。
使用到的NEST产品：
96孔高吸附酶标板[NEST]
10μL/200μL/1000μL吸头[NEST]
微量离心管[NEST]
15/50ml离心管[NEST]
