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2023-08-0913902 次浏览
解决计划 | 293T细胞培养攻略

细胞攻略

293T细胞培养

细胞特点


01.细胞贴壁能力比较弱

293T细胞是贴壁细胞，但其贴壁能力比较弱，容易泛起明显的成片脱落现象。好比：运输低温及震荡、在室温条件下静置时间过长、添加的培养基或其他试剂温度过低、培养时细胞密度过高、细胞聚集时未吹散、加液奏乐时触碰了细胞外貌等。
若脱落现象不严重应将细胞尽快放回培养基继续培养，若泛起大片脱落的现象需要收集细胞重新消化吹散再接种。
建议使用经TC处理后的培养器皿培养细胞，如NEST细胞培养瓶、NEST细胞工厂等。




02.细胞自己偏嗜酸性，培养基消耗较快

293T细胞在略偏酸性的情况下生长状态更好，在培养历程中需要时刻注意培养基的pH值。
在细胞密度抵达70%以上时，细胞培养基的消耗速度较快，需要时刻视察并实时换液。


03.细胞生长时聚集成岛

293T细胞生长时呈岛状聚集生长，会逐步向外扩散直到完全融合。


04.细胞聚集成团之后很难再吹散

293T细胞传代历程中一定要注意吹散细胞，同时接种的密度不可过高。密度过高容易使细胞抱团，导致难以再次吹散，会在培养器皿中形成类似于球状的聚集体贴壁生长。导致纵然培养条件合适细胞也难以生长。




细胞培养


01.细胞冻存

1. 随着传代的次数增加，293T细胞会泛起生长状态下降，泛起突变等现象。所以我们需要在细胞购进时就进行大宗冻存，以包管实验的稳定性和连续性。
2. 在细胞对数生恒久进行冻存，从而增加细胞苏醒成活率。
3. 倒去细胞上清液并洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后移除。
5. 镜下视察，当293T细胞变圆且细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基奏乐混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.凭据计数结果加入细胞冻存液重悬细胞，密度为3×10^6个/mL。
9. 将细胞重悬液分装进细胞冻存管，进行冻存。
10. 液氮气象生存24小时后建议苏醒一管检测细胞存活率，细胞状态等，若细胞活性及格可恒久生存，若细胞活性及格率低于80%建议重新冻存。
注：NEST生物样本库解决计划提供细胞冻存全流程产品，如NEST冻存管、NEST冻存液、NEST样本治理系统、NEST冻存架等。




02.细胞传代

1. 当细胞生长至汇合率抵达80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 吸取洁净原有培养基，加入3-4mL常温PBS轻轻润洗细胞10-20秒后舍弃PBS。
3. 加入适量胰酶，轻轻晃动细胞培养瓶使胰酶与细胞充分混匀，彻底消化细胞。
4. 当细胞间隙变大，但并未完全脱落时在细胞培养瓶中加入培养基，终止消化�；煸认赴�，900rpm离心3-5分钟后舍弃上清液。
5. 加入新的培养基重选细胞并均匀分到新的细胞培养瓶中，静置培养。
6. 传代完成24小时后建议视察细胞并换液，以去除死亡细胞。 
注：NEST细胞培养瓶规格齐全，外貌经过TC处理，细胞贴壁效果极佳。同时NEST已推出新品细胞培养基及细胞盐溶液（PBS），助力细胞培养。



03.细胞苏醒

1. 当细胞传代次数过多（凌驾50代），细胞状态变差时或细胞泛起污染事故时，需要抛弃原有细胞并对一开始冻存的细胞进行苏醒。
2. 翻开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 检察NEST样本治理系统的纪录，凭据纪录从液氮气象中取出冻存的细胞，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 加入培养基中并混匀后转入细胞培养瓶。
5. 放回37摄氏度、3%二氧化碳和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天视察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入新鲜培养基。注：可使用南宫28新推出细胞苏醒仪替代原始细胞苏醒历程，细胞苏醒时间短，细胞存活率高。




Q&A


01.细胞密度如何盘算

常用的细胞密度指细胞相关于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以大概的用细胞所占培养容器底面积百分比体现，即显微镜下视察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值。
这种盘算方法优点是直观简便，但受限于单个细胞在差别的生长密度时所占用的培养面积差别，导致盘算并不严谨。


02.培养历程中细胞碎片较多

  • 细胞内的玄色颗粒是细胞外排泄泡以及细胞器的折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变。而细胞对培养情况不适应、缺乏营养、渗透压有异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议适当改变培养条件。
  • 细胞外的玄色颗粒为细胞碎片和细胞代谢产品，需要先舍弃原有培养基后用PBS润洗清除细胞碎片，加入新的培养基后继续培养。
    如果润洗无法清除细胞碎片，可以等细胞密度处在70-80%左右时消化处理细胞，终止消化之后混匀细胞，收集细胞悬液在900-1000rpm条件下离心3分钟，舍弃上清液。重悬细胞→离心→再重悬后将细胞悬液接种到新的培养瓶。
    第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果碎片许多，建议用PBS多次润洗细胞。


03.细胞泛起聚团现象

  • 细胞传代历程中需要尽可能地吹散细胞，并在显微镜下确认细胞基天职散后再把细胞接种到培养瓶中。
  • 优质的培养体系能有效制止细胞吹散后在贴壁时再聚团的现象， 也可以减轻细胞聚团后无法重新摊开生长的症状。
  • 培养历程中轻微聚团可以稍微延长消化时间，让大团细胞块下沉后吸取上层的疏散细胞进行传代。若聚团过于严重建议重新培养或者更换培养体系。



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